RESUMO Genótipos de citros mostram uma gama de resistência à infecção de Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), agente causal do cancro cítrico asiático (ACC). O objetivo deste estudo foi avaliar um método de inoculação em folha destacada para comparar nove genótipos diferentes de citros que apresentam graus de resistência à ACC e, avaliar a infecção, colonização e desenvolvimento de sintomas das variedades utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A inoculação de Xcc em folhas foi realizada através de ferimentos produzidos com agulhas. Aos 7, 10 e 13 dias após a inoculação (DAI), diâmetros de lesão foram mensurados. A variedade Pêra IAC foi a mais resistente ao patógeno e apresentou lesões com menor diâmetro e a variedade Washington foi a mais suscetível e apresentou as maiores lesões, indicando baixa resistência à Xcc. As imagens de MEV foram feitas no desenvolvimento da lesão, e secções foram cortadas a partir das lesões da doença nas variedades testadas. A variedade mais resistente, Pêra IAC, teve aberturas estomáticas menores e produziram uma maior quantidade de exsudados foliares em comparação com a variedade Washington. Nossa hipótese é que os exsudados podem conter compostos tóxicos de Xcc e, portanto, pode ser um mecanismo de defesa para a infecção por Xcc, embora novas pesquisas são necessárias para estabelecer quaisquer efeitos antibióticos de exsudato contra o cancro cítrico.

ABSTRACT Citrus genotypes show a broad range of resistance to infection with Xanthomonas citri subsp citri (Xcc), the causal agent of Asiatic citrus canker (ACC). The aim of this study was to evaluate a detached leaf inoculation method to compare nine different citrus genotypes that exhibit varied resistance levels to ACC, and to evaluate infection, colonization and symptom development of the varieties by using Scanning Electron Microscopy (SEM). Inoculation of Xcc in the leaves was carried out by producing injuries with needles. Lesion diameters were measured at 7, 10 and 13 days after inoculation (DAI). The variety Pera IAC was most resistant to the pathogen and had lesions with smaller diameters, while the variety Washington was most susceptible and had the largest lesions, indicating low resistance to Xcc. SEM images were taken from the lesion development, and sections were obtained from the disease lesions in the tested varieties. The most resistant variety, Pera IAC, had smaller stomatal openings and produced greater quantity of foliar exudates, compared with the variety Washington. We hypothesize that the exudates may contain Xcc toxic compounds and thus may be a defense mechanism against infection by Xcc, but further research is required to establish any antibiotic effects of the exudates against citrus canker.

A limpeza clonal seguida de pré-imunização com complexos protetivos do Citrus tristeza virus(CTV) possibilitaram o cultivo comercial da laranja Pêra, variedade de relevante importância para a citricultura brasileira, mas sensível ao vírus. O emprego de isolados fracos protetivos em outras variedades de citros, mesmo com maior tolerância ao CTV, pode ser também de interesse para evitar a dispersão de isolados severos. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar, por meio da análise SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) do gene da proteína do capsídeo, isolados de CTV presentes em plantas das cultivares de laranjas doce Pêra, Hamlin e Valência, propagadas de quatro fontes de borbulhas: 1) clones velhos, 2) clones nucelares, 3) clones microenxertados e 4) clones microenxertados pré-imunizados com o isolado fraco protetivo 'PIAC' do CTV. Avaliou-se ainda a correlação dos padrões SSCP obtidos com intensidade de caneluras no lenho, vigor e produção de frutos. Resultados do SSCP demonstraram baixa diversidade genética entre isolados presentes em diferentes plantas da mesma variedade e mesma fonte de borbulhas, e em alguns casos, em diferentes fontes de borbulhas e variedades. Para os sintomas de tristeza, observou-se menores intensidades em plantas dos clones novos, microenxertados e, dos microenxertados pré-imunizados sobre clones velhos das três variedades. Os padrões SSCP e a sintomatologia observados sugeriram que complexos mais fortes do CTV estão infectando as plantas dos clones velhos das três variedades. A estabilidade do complexo protetivo foi observada nos padrões SSCP dos isolados de CTV de alguns dos clones microenxertados e pré-imunizados. Concluiu-se que as alterações detectadas em outros perfis eletroforéticos deste tratamento não provocaram a perda da capacidade protetiva do isolado 'PIAC' de CTV, inoculado na pré-imunização.

Clonal cleaning, followed by pre-immunization with protective complexes of Citrus tristeza virus(CTV), allowed the commercial cultivation of Pêra sweet orange, a variety that has great importance for Brazilian citriculture but is sensitive to the virus. The use of mild protective isolates in other citrus varieties, even those more tolerant to CTV, can also be of interest to prevent the spread of severe isolates. The aim of this study was to characterize, by means of SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism) analysis of the coat protein gene, CTV isolates present in plants of the sweet orange cultivars Pêra, Hamlin and Valencia propagated from four budwood sources: 1) old lines, 2) nucellar lines, 3) shoot-tip-grafted lines, and 4) shoot-tip-grafted lines pre-immunized with the mild CTV protective isolate 'PIAC'. We also evaluated the correlation of the obtained SSCP patterns to stem pitting intensity, tree vigor and fruit yield. SSCP results showed low genetic diversity among the isolates present in different trees of the same variety and same budwood source and, in some cases, in different budwood sources and varieties. Considering tristeza symptoms, lower intensity was noted for plants of new, shoot-tip-grafted and pre-immunized shoot-tip-grafted lines, compared to old lines of the three varieties. The observed SSCP patterns and symptomatology suggested that more severe CTV complexes infect the plants of old lines of all three varieties. The protective complex stability was observed in the SSCP patterns of CTV isolates of some shoot-tip-grafted and pre-immunized clones. It was concluded that the changes detected in other electrophoretic profiles of this treatment did not cause loss of the protective capacity of CTV isolate 'PIAC' inoculated in the pre-immunization.

The use of tolerant rootstocks and preimmunization has satisfactorily controlled losses associated with the Citrus tristeza virus (CTV). Several researchers have shown that CTV mild isolates that are selected in the same region where they are used are superior to isolates obtained from other areas. Thus, budwoods of 20 outstanding citrus trees were collected in north and northwestern Paraná state (Brazil) citrus-producing areas and established to be used in a preimmunization program. These budwoods were tested to evaluate the potential protection of the inherently present viral complex. Based on biological indexing and molecular characterization of the capsid protein gene by RFLP (restriction fragment length polymorphism, which indicated that the plants were infected with mild isolates of CTV), some of the selected plants could be used in a preimmunization program. These potentially mild and protective isolates were challenged with severe 'Rolândia' isolate inoculations by grafting and by the brown citrus aphid (Toxoptera citricida Kirkaldy) vector, which was faster in transmitting the virus. Some isolates had a better protective value than others, particularly when challenged with the severe CTV isolate. The SSCP (single strand conformational polymorphism) molecular analysis was an excellent complementary tool for monitoring the performance of the experiments and the stability of the viral complex present in the plants. Isolate number 1, collected in the municipality of Cruzeiro do Sul (CS-1), was the most promising for protecting commercial Pêra sweet orange (C. sinensis L.) orchards in northern and northwestern Paraná. The Rolândia severe CTV isolate was stable and had a high genetic divergence among the severe isolates used as a control (Capão Bonito and Barão B) and all of the isolates tested.

Plants of Pera sweet orange on Rangpur lime rootstocks, from orchards of the northwest and north of Paraná state, Brazil, were evaluated for severity of symptoms and genetic diversity of Citrus tristeza virus. The severity of symptoms was evaluated by the development of tree, fruit size and stem pitting symptoms. Isolates that infect these plants were compared with known mild and severe isolates by analysis of restriction fragments length polymorphism (RFLP) of the coat protein nucleotide sequences (CPNS), amplified by the polymerase chain reaction (PCR) and undergone digestion with the restriction enzymes Hinf I and Rsa I. The severity of symptoms showed that the analyzed plants from the northwest orchards presented mild to moderate tristeza symptoms, while the plants from the north orchards exhibited moderate to severe symptoms. The RFLP analysis revealed that the CTV isolates are constituted by haplotype mixtures. Rsa I was the enzyme that best discriminated the genetic diversity among the analyzed isolates of CTV. Two main groups were generated by the UPGMA analysis. The isolates from the northwest orchards grouped with most of the mild isolates used as control, and a great part of the isolates from the north orchards, was correlated with the severe isolate Capão Bonito. Correlation between the stem pitting intensity and RFLP patterns, was demonstrated with some exceptions. The failure of protection of some isolates and the contamination of the rootstocks by the severe isolates, in field nursery conditions, before grafting with scions with mild isolates, were the hypotheses considered to explain the occurrence of severe CTV isolates in the North area of Paraná State.

A Clorose variegada dos citros (CVC) é uma doença causada pela bactéria de xilema Xylella fastidiosa Wells. A disseminação ocorre por meio de insetos vetores pertencente à ordem Hemiptera, família Cicadellidae (subfamília Cicadellinae), os quais transmitem a bactéria depois de se alimentarem em plantas contaminadas. Neste trabalho, objetivou-se identificar e monitorar as espécies de cigarrinhas vetoras em um pomar comercial no município de Paranavaí, Paraná. O experimento foi realizado em um talhão comercial de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck), variedade Pera, com 1.000 plantas de dez anos de idade. A amostragem foi realizada por meio de armadilhas adesivas amarelas, distribuídas na área periférica e central do pomar, com duas repetições por rua amostrada. As etiquetas foram distribuídas entre a 5ª e 30ª plantas em 10 ruas, totalizando 20 armadilhas que foram renovadas no pomar, a cada trinta dias, durante o período de avaliação que foi entre junho de 2005 e setembro de 2006. As principais espécies de Cicadellinae capturadas foram Acrogonia citrina Marucci & Cavichioli, Dilobopterus costalimai Young e Macugonalia cavifrons Stal. Essas espécies apresentaram ocorrência constante e frequência de 3,97%, 4,2%, 13,0% respectivamente, em relação ao total de cigarrinhas coletadas.

Citrus variegated chlorosis (CVC) is the disease caused by the bacteria Xylella fastidiosa Wells. Dissemination occurs through insect vectors belonging to the order Hemiptera, family Cicadellidae (subfamily Cicadellinae), which transmit the bacteria after feeding on infected plants. The objective of this study was to identify the species of insect vectors in an orchard in the municipality of Paranavaí, in the State of Paraná. The experiment was conducted in a commercial stand of sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck), Pêra variety with 1,000 10-year-old plants. Monitoring was performed using yellow sticky traps, distributed in the central and peripheral areas of the orchard with two traps on each one. The stickers were distributed between the 5th and 30th plant in each 10 rows, totaling 20 traps in the orchard and renewed every thirty days during the evaluation period, which was between June 2005 and September 2006. The main species caught were Cicadellinae Acrogonia citrina Marucci & Cavichioli Dilobopterus costalimai Young and Macugonalia cavifrons Stal. These species occurred constantly, with frequencies of 3.97%, 4.2%, and 13.0% respectively, compared to the total leafhoppers collected.

O objetivo deste trabalho foi monitorar a manutenção da estabilidade de isolados protetores contra Citrus tristeza virus (CTV) em clones selecionados de laranja 'Pêra' (Citrus sinensis) pré-imunizados ou infectados naturalmente pelo vírus, após sucessivas propagações clonais. O trabalho foi realizado em condições de campo, no norte do Estado do Paraná. A análise do gene da capa protéica (GPC) de 33 isolados, coletados de 16 clones de laranjeira 'Pêra', foi realizada com o uso da técnica polimorfismo conformacional da fita simples (SSCP). Inicialmente, os isolados foram caracterizados por meio de sintomas de caneluras observados nos clones. Em seguida, o genoma viral foi extraído e utilizado como molde para a amplificação do GCP com uso da transcrição reversa da reação em cadeia da polimerase (RTPCR). Os perfis eletroforéticos dos produtos da RTPCR foram analisados com emprego do coeficiente de Jaccard e do método UPGMA. A maioria dos clones apresentou sintomas fracos a moderados de caneluras, bem como alterações nos perfis dos isolados de CTV. Contudo, a estabilidade dos complexos protetores foi mantida, com exceção dos isolados presentes em dois dos clones analisados. Foi observada baixa variabilidade genética nos isolados durante os anos avaliados.

The objective of this work was to monitor the maintenance of Citrus tristeza virus (CTV) protective isolates stability in selected clones of 'Pêra' sweet orange (Citrus sinensis), preimmunized or naturally infected by the virus, after successive clonal propagations. The work was carried out in field conditions in the north of Paraná State, Brazil. Coat protein gene (CPG) analysis of 33 isolates collected from 16 clones of 'Pêra' sweet orange was performed using single strand conformational polymorphism (SSCP). Initially, the isolates were characterized by symptoms of stem pitting observed in clones. Then viral genome was extracted and used as template for the amplification of CPG by reverse transcription polimerase chain reaction (RTPCR). RTPCR products electrophoretic profiles were analyzed using the Jaccard coefficient and the UPGMA method. The majority of the clones had weak to moderate stem pitting symptoms and its CTV isolates showed alterations in the SSCP profiles. However, the stability of the protective complex has been maintained, except for isolates from two analised clones. Low genetic variability was observed within the isolates during the studied years.

A Clorose variegada dos citros (CVC) é uma importante doença que ocorre nos citros, cujo agente causal é a bactéria Xylella fastidiosa, Wells. A bactéria depende, obrigatoriamente, de insetos vetores para sua disseminação, que são as cigarrinhas sugadoras do xilema (Hemiptera: Cicadellidae, Cicadellinae). No presente estudo objetivou-se avaliar a flutuação populacional de espécies de cigarrinhas nas diferentes variedades de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck], Natal, Pêra, Valência e Folha Murcha, em um pomar comercial localizado na região Noroeste do Paraná, no período de janeiro de 2000 a dezembro de 2002. Amostragens quinzenais foram realizadas com o uso de armadilhas adesivas amarelas, num total de 24 armadilhas em cada avaliação. Após a identificação das espécies observou-se, que as mais representativas foram Dilobopterus costalimai da tribo Cicadellini e Acrogonia citrina da tribo Proconiini, sendo que a variedade de laranja Pêra apresentou o maior número de espécies vetoras durante os anos avaliados.

The aim of the present study was to assess the population flutuation of the sharpshooters species subfamily Cicadellinae belonging to the tribes Cicadellini and Proconiini, in sweet orange [Citrus sinensis( L). Osbeck] commercial orchards of the northwest region of Paraná State , Brazil. Samplings were carried out the employing every time 24 yellow sticky cards. Identification of the species showed that the most representative were Dilobopterus costalimai of the Cicadellini tribe and Acrogonia citrina of the Proconiini tribe.

O experimento teve como objetivo caracterizar biológica e molecularmente os isolados de CTV, obtidos de árvores de laranja Pêra em pomares das regiões Norte e Noroeste do Paraná, visando selecionar isolados fracos do Citrus tristeza virus com capacidade protetiva para pré-imunização. Os resultados apontaram sintomas fracos a moderados de caneluras e revelaram similaridade genética da maioria dos isolados analisados e o isolado fraco controle, sugerindo que as plantas selecionadas estão infectadas por haplótipos fracos de CTV, com potencial para serem utilizadas como plantas matrizes.

A cross-protection program citrus tristeza disease, caused by Citrus tristeza virus (CTV) has been developed in the Parana State, to obtain Pera orange mother plants. Thus, 20 plants were selected in the orange commercial fields of the North and Northwest region. Comparisons between mild and severe recognized isolates were made. The results showed mild-to-moderate stem pitting symptoms and the great majority of the isolates grouped up with the mild control isolate. These results suggest that the plants selected were infected by CTV mild haplotypes showing that they have mother plant potential.

As cigarrinhas das famílias Cicadellidae e Cercopidae são vetores da bactéria Xylella fastidiosa Wells, causadora da Clorose variegada dos citros. Esta doença traz sérios prejuízos à lavoura de citros no Noroeste Paranaense, e é estudada no Brasil desde 1987, quando foi descoberta pela primeira vez na região de Colina, São Paulo. Os vetores transmitem a X. fastidiosa quando se alimentam sugando a seiva do xilema, local onde a bactéria se instala, obstruindo a passagem da seiva. Este trabalho teve o objetivo de avaliar a ocorrência das cigarrinhas vetoras Dilobopterus costalimai e Acrogonia citrina em pomar comercial de citros. O experimento foi realizado no sítio "Laranjeiras I", município de Nova Esperança, região noroeste do Paraná, no período de julho de 2004 a agosto de 2006. Foram feitas amostragens mensais, por meio de armadilhas adesivas amarelas (Biocontrole®), nas variedades de laranjeiras [Citrus sinensis (L.) Osbeck] Folha Murcha, Valência, Pêra e Natal. Nas variedades Pêra e Valência, a cigarrinha mais capturada foi Dilobopterus costalimai. Os meses de maior ocorrência das espécies foram entre dezembro e maio de cada ano.

The sharpshooters of the families Cicadellidae and Cercopidae are vectors of Xylella fastidiosa (Wells), which causes citrus variegated chlorosis. This disease causes severe damage to the Paraná citrus industry, and it has been studied in Brazil since 1987, when it was discovered for the first time in the area of Colina, SP. The vectors transmit X. fastidiosa when they feed on the xylem sap, where the bacteria settles, obstructing the passage of the sap. This work had the objective of evaluating the occurrence of the vector sharpshooter Dilobopterus costalimai and Acrogonia citrina in a commercial citrus orchard during the period between July 2004 and August 2006. The experiment was accomplished in the Laranjeiras I farm, in the city of Nova Esperança, northwestern Paraná. The collections were undertaken monthly, and yellow stick traps (Biocontrole®) was used as a sampling method in Folha murcha, Valência, Pêra and Natal oranges trees [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. In Pêra and Valência trees, the most often captured sharpshooter was Dilobopterus costalimai. The months of higher occurrence of these species were between December and May of each year.

O presente trabalho teve como objetivo identificar 11 isolados de Guignardia citricarpa, agente causal da mancha preta dos citros (MPC), obtidos de frutas cítricas sintomáticas de diferentes regiões geográficas, por meio da PC R e caracterização morfofisiológica das estruturas propagativas, esporulação e crescimento micelial em diferentes meios de cultura, temperaturas e regimes de luz, nas condições de laboratório. Pelo teste de PCR, todos os isolados foram identificados como o patógeno G. citricarpa. Os isolados caracterizados foram submetidos às temperaturas de 20, 25 e 30ºC, em regime de luz contínua, escuro contínuo e fotoperíodos de 12 horas, durante 24 dias. Utilizaram-se os meios de cultura aveia-ágar (AA), batata-dextrose-ágar (BDA) e cenoura-dextrose-ágar (CDA). Os resultados mostraram que ocorreu interação entre os diferentes meios de cultura, temperaturas e fotoperíodos. O meio de cultura que melhor estimulou o crescimento micelial foi o CDA a 25ºC sob o fotoperíodo de 12h. A maior produção de esporos (conídios) foi verificada no meio BDA a 20ºC, no fotoperíodo de 12 horas. No meio CDA, não ocorreu esporulação de nenhum isolado. Sob a temperatura de 30ºC, foi verificada apenas a produção de hifas e picnídios para a maioria dos isolados, em todos os meios de cultura e fotoperíodo testados.

The present work aims to identify 11 isolates of Guignardia citricarpa, the causal agent of the citrus black spot (CBS), obtained from affected fruit in different geographical regions, through PC R and morphophysiological characterization of propagative structures, sporing and mycelial growth in different means of culture, temperatures and photoperiods, under laboratory conditions. Through the PCR test, all isolates were identified as being the G. citricarpa pathogen. The characterized isolates were subjected to evaluations at temperatures of 20, 25 and 30ºC, in continuous light, continuous darkness, and alternating 12 hours light and 12 hours darkness, during 24 days. The study used oat-agar (OA), potato-dextrose-agar (PDA) and carrot-dextrose-agar (CDA) as means of culture. The results showed an interaction between the different means of culture, temperatures and photoperiods. The mean of culture that best stimulated mycelial growth was CDA at 25ºC under the 12-hour photoperiod. The greatest spore (conidia) production was verified in PDA at 20ºC in the 12-hour photoperiod. There was no sporing of any isolate in the CDA mean of culture. Under the 30ºC temperature, the study verified only the production of hyphae and picnids in most isolates, in all means of culture and photoperiods.